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Institut für Medizinische Diagnostik Berlin-Potsdam MVZ GbR 
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MOLEKULARGENETIKDie Molekulargenetik befasst sich mit den molekularen Grundlagen erblicher Merkmale und Erkrankungen. Schätzungen zufolge haben ca. 6000 Erkrankungen eine genetische Ursache. Für mehr als 3000 dieser genetischen Erkrankungen des Menschen konnte der molekulare Defekt identifiziert werden, so dass eine genetische Diagnostik möglich ist. Im Gegensatz zur Zytogenetik die Veränderung der Chromosomen mikroskopisch untersucht, befasst sich die Molekulargenetik mit der Analyse von Nukleinsäureveränderungen im submikroskopischen Bereich. In definierten Abschnitten der Erbsubstanz (Gene) kommen Veränderungen, sog. Mutationen vor, die mit bestimmten Erkrankungen einhergehen können bzw. ihnen kausal zu Grunde liegen.  Angesichts der rasanten Fortschritte in der biomedizinischen Forschung (Entschlüsselung des Genoms, neue Methoden, Auffindung krankheitsassoziierter Gene) gewinnt die humangenetische Diagnostik in vielen Bereichen der Medizin zunehmend an Bedeutung. Mittlerweile setzt sich die Erkenntnis durch, dass fast alle Erkrankungen bzw. ihre Ausprägung eine genetische Komponente besitzen. Beispiele für die Anwendung der Molekulargenetik sind weiter unten dargestellt. Wie in anderen Bereichen der Medizin, ist für eine genetische Diagnostik die Indikationsstellung, wie z. B. die molekulare Sicherung einer klinischen Verdachtsdiagnose, erforderlich. Die ungezielte Untersuchung von Genen nach Mutationen ohne zugrunde liegende Fragestellung liefert keine verwertbaren Aussagen und sollte daher unterlassen werden. Eine genetische Diagnostik sollte nicht isoliert durchgeführt werden, sondern im Zusammenspiel mit der genetischen Beratung und den klinischen Fächern Teil eines Gesamtkonzeptes sein. Die Molekulargenetik befasst sich mit den molekularen Grundlagen erblicher Merkmale und Erkrankungen. Schätzungen zufolge haben ca. 6000 Erkrankungen eine genetische Ursache. Für mehr als 3000 dieser genetischen Erkrankungen des Menschen konnte der molekulare Defekt identifiziert werden, so dass eine genetische Diagnostik möglich ist. Im Gegensatz zur Zytogenetik die Veränderung der Chromosomen mikroskopisch untersucht, befasst sich die Molekulargenetik mit der Analyse von Nukleinsäureveränderungen im submikroskopischen Bereich. In definierten Abschnitten der Erbsubstanz (Gene) kommen Veränderungen, sog. Mutationen vor, die mit bestimmten Erkrankungen einhergehen können bzw. ihnen kausal zu Grunde liegen. Eine molekulargenetische Diagnostik kann aus folgenden Gründen für Patienten und deren Angehörige vorteilhaft sein:
Monogene Erkrankungen Inzwischen sind zahlreiche Polymorphismen beschrieben worden, die mit häufigen multifaktoriellen Erkrankungen wie z.B. Herzinfarkt, Osteoporose oder Thrombose assoziiert sind. Die Häufung solcher multifaktorieller Erkrankungen in Familien zeigt, dass es ein erhöhtes genetisches Risiko gibt, welches mit den herkömmlichen biochemischen Methoden häufig nicht nachweisbar ist. Hierbei handelt es sich um die klassischen Erbkrankheiten, deren Entstehung auf eine Veränderung in einem einzelnen Gen zurückzuführen sind. Die monogenen Erkrankungen sind (sehr) selten, zeigen in ihrer Gesamtheit jedoch eine weite Verbreitung. Es wird vermutet, dass bei 3% bis 7% der Bevölkerung Erbkrankheiten vorliegen, die mit unterschiedlich ausgeprägten gesundheitlichen Störungen einhergehen können. Monogene Erkrankungen sind ferner durch eine hohe Penetranz charakterisiert. Dies bedeutet, dass Träger einer Mutation im verantwortlichen Gen auch mit großer Wahrscheinlichkeit im Laufe ihres Lebens erkranken. Bei vielen dieser Erkrankungen liegt die Penetranz sogar bei 100%, wie beispielsweise bei der Frühform der Alzheimer-Erkrankung, der Chorea Huntington oder der Cystischen Fibrose (Mukoviszidose). Hinweis: Bei Verdacht auf eine erbliche Erkrankung sollte die molekulargenetischen Analyse im Rahmen einer genetischen Beratung durchgeführt werden. Diese dient der Aufklärung des Patienten und soll eine Entscheidungshilfe für bzw. gegen eine genetische Untersuchung darstellen. Bei den prädiktiven genetischen Untersuchungen ist eine genetische Beratung durch das seit dem 01. 02. 2010 geltende Gendiagnostikgesetz vorgeschrieben. Komplexe genetische Erkrankungen Die meisten Erkrankungen mit einer genetischen Komponente sind allerdings komplexer Natur und multifaktoriell bedingt. Das heißt, sie werden durch ein Wechselspiel verschiedener genetischer und nicht-genetischer Faktoren (z.B. Umwelt) hervorgerufen. Genetische Varianten, die mit bestimmten Erkrankungen assoziiert sind, können ermittelt werden, um das individuelle Erkrankungsrisiko abzuschätzen. So haben Träger einer bestimmten Genvariante des Apolipoproteins (APOE4) ein leicht erhöhtes Risiko, die Alzheimer-Krankheit zu entwickeln. Im Gegensatz dazu liegt das Risiko, an Alzheimer-Krankheit zu erkranken, bei 100%, wenn Mutationen in den Genen APP, PSEN1 oder PSEN2 vorliegen. In diesem Fall wäre die Erkrankung monogen verursacht. Ein Beispiel: Das durchschnittliche Risiko einer Herz-Kreislauf-Erkrankung ist in Trägern einer bestimmten Variante des KIF6-Gens (Trp719Arg) leicht erhöht. Insgesamt sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen natürlich sehr viel stärker von den Lebensgewohnheiten abhängig, wie beispielsweise dem Rauchen, falscher Ernährung und zu wenig sportlicher Aktivität. Somit kann ein „ungünstiger Genotyp“ durch eine vernünftige Lebensweise ausgeglichen werden. Im Falle einer klinisch bereits manifesten Herz-Kreislauf-Erkrankung sind die Träger der KIF6-Variante allerdings im Vorteil, denn sie zeigen eine verbesserte Ansprechrate bei bestimmten Statin-Therapien.  Hinweis: In jüngster Zeit sind zahlreiche Genvarianten identifiziert wurden, die an einer Disposition zu multifaktoriellen Erkrankungen beteiligt sind. Obwohl einige dieser Genvarianten neue Einblicke in die Pathogenese komplexer genetischer Erkrankungen gewähren, ist ein klinischer Nutzen häufig nicht gegeben. Dies liegt darin begründet, dass diese Genvarianten in der Regel eine geringe Penetranz haben und nur mit wechselndem Gewicht und im Zusammenspiel mit anderen Genvarianten und exogenen Einflüssen zur Krankheitsentstehung führen. Da die Kenntnis solcher Genvarianten mit geringer Aussagekraft keine Konsequenzen hat, wird eine genetische Testung von den Fachgesellschaften nicht empfohlen. Pharmakogenetik Die Molekulargenetik spielt also nicht nur beim Nachweis erblicher Erkrankungen eine Rolle, sondern dient auch der Bestimmung von Sequenzvarianten, die im Kontext bestimmter Therapien eine wichtige Bedeutung besitzen. Die Pharmakogenetik befasst sich mit Sequenzvarianten, die die Wirksamkeit und Nebenwirkungen von Medikamenten beeinflussen. Die personalisierte Therapie berücksichtigt die individuelle genetische Ausstattung von Patienten bei der Medikamentenwahl. Dies geschieht im Sinne einer möglichst wirksamen Medikation bei gleichzeitig geringen Nebenwirkungen. Suszeptibilitäts- und Resistenzgene für Infektionskrankheiten Genetische Varianten können unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft sein. Beispielweise sind Individuen aufgrund ihrer genetischen Ausstattung unterschiedlich empfänglich gegenüber Infektionen mit bestimmten Krankheitserregern. Träger einer Variante des CCR5-Gens (CCR5 delta 32bp) sind beispielsweise vor einer Infektion durch das HI-Virus weitgehend geschützt. Das Wildtyp-Allel kodiert für einen Korezeptor, den das Virus zum Eintritt in die Wirtszelle benötigt. Das Genprodukt der CCR5 delta 32bp-Variante ist defekt und kann daher von HIV nicht für den Eintritt in die Zelle genutzt werden. Genetische Faktoren beeinflussen nicht nur die Empfänglichkeit gegenüber einer Infektion, sondern können auch den Verlauf der Erkrankung mitbestimmen. Beispielsweise kommt es bei Hepatitis C infizierten Patienten mit einem bestimmten Genotyp des IL28B zu einer doppelt so hohen spontanen Ausheilungsrate der Infektion. Zusätzlich weisen Patienten mit diesem Genotyp ein wesentlich besseres Ansprechen auf eine antivirale Therapie auf. Somit handelt es sich bei dem IL28B-Gen um eine Kombination aus einem genetischen Prognose- und Therapiemarker. Methoden In unserem Labor kommen die folgenden molekulargenetischen Methoden zum Einsatz: 1. Nachweis einzelner Sequenzvarianten an bekannten Positionen (=Genotypisierungen) - Allelspezifische Polymerasekettenreaktion (PCR) - Allelische Diskriminierung (Schmelzkurvenanalyse im Lightcycler) Bei diesem PCR-basierten Verfahren werden zusätzlich zu den Primern für die Amplifikation sog. Hybridisierungssonden eingesetzt. Dabei handelt es sich um ein Paar Oligonukleotide, die benachbart auf dem zu untersuchenden DNA-Abschnitt binden: eine sog. Sensor-Sonde, welche die variable Sequenz überdeckt, und die sog. Anker-Sonde. Bei optimaler Bindung (=Hybridisierung) entsteht durch das Zusammenwirken von Farbstoffen an den benachbarten Enden der Hybridisierungssonden ein Fluoreszenzsignal. Eine Änderung der Sequenz im Bereich der Sensor-Sonde, z. B. durch eine Sequenzvariante, führt zu einer Schmelzpunkt-Erniedrigung des Hybridisierungsproduktes. Anhand einer Schmelzkurvenanalyse können Sequenzvarianten detektiert werden. 2. Komplette Untersuchung von Krankheitsgenen oder -genabschnitten Oft ist es nicht ausreichend, nur bestimmte Veränderungen in einem Gen zu untersuchen. Bei vielen genetischen Erkrankungen können unterschiedliche Veränderungen in der Nukleinsäureabfolge (DNA-Sequenz) der Erkrankung zu Grunde liegen. Wir führen daher bidirektionale Sequenzierungen aller kodierenden Exons mit flankierenden Bereichen (Exon- /Introngrenzen) von Krankheitsgenen durch. Falls Exons bekannt sind, die in erster Linie Veränderungen aufweisen (sog. “Hot spot Regionen”), werden diese Regionen im Rahmen einer Stufendiagnostik zuerst analysiert. Bei der hier verwendeten Methode zur Sequenzanalyse handelt es sich um die Didesoxymethode nach Sanger, welche auch Kettenabbruch-Synthese genannt wird. Als Sequenzier-Reaktion kommt heutzutage eine Variation der PCR, genannt “Cycle-Sequencing”, zum Einsatz. Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz wird durch das Enzym DNA-Polymerase mittels sequenzspezifischer Primer einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert. Hierbei werden neben den normalen Nukleotiden (dNTPs) sog. “Kettenabbruch-ddNTPs” verwendet, die keine 3’-Hydroxygruppe besitzen. Eine Verlängerung des DNA-Stranges durch eine DNA-Polymerase ist somit nicht mehr möglich. Jedes der vier ddNTPs ist mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert. Bei der Auftrennung im Kapillar-Sequenzierer kann die Sequenz anhand der jeweiligen Farbstoffe am Ende der unterschiedlich langen DNA-Fragmente abgelesen werden. 3. MLPA (Multiplex-Ligation dependent Probe Amplification) Einige Erkrankungen werden durch größere Deletionen in Genen oder Genduplikationen hervorgerufen. Für die Bestimmung solcher Veränderungen hat sich die relativ neue MLPA-Methode bewährt. Mit ihr können gleichzeitig verschiedene Gene bzw. verschiedenen Genregionen auf Veränderungen der Gendosis untersucht werden. Kontakt Schnellzugriff Kontakt Impressum |
