Präanalytische Faktoren bei der Messung des Blutbildes

Grundlagen

Die Messung der verschiedenen Parameter des Blutbildes erfolgt heute mit modernen Hämatologieautomaten. Diese messen ein Vielzahl optischer und elektrischer Signale von jeder einzelnen Zelle und differenzieren darüber die verschiedenen Zellpopulationen des Blutes. Da dieser Differenzierung 10 bis 30.000 Zellen zugrunde liegen, ist sie präziser als die mikroskopische Differenzierung.
Die Begriffe Präzision, großes und kleines Blutbild, Parameter des Blutbildes, Funktionsweise des Hämatologieautomaten sind in den Kapiteln „Parameter des Hämatologieautomaten“ und „Funktionsweise des Hämatologieautomaten“ ausgeführt.

Biologische Einflussgrößen vor der Analyse wie Nahrungsaufnahme, Tageszeit, körperliche Belastung, langes Stauen der Venen und die Körperhaltung bei der Blutentnahme (im Sitzen oder Liegen) aber auch Probenlagerung bis zur Messung (Zeitdauer und Temperatur) und Probentransport ins Labor können die Messwerte in größerem Ausmaß beeinflussen als biologische und analytische Varianz. Diese Einflussgrößen werden präanalytische Faktoren genannt.
Im klinischen Alltag können präanalytische Faktoren die Messwerte so stark auslenken, dass die Messwerte die Situation des Patienten nicht mehr korrekt widerspiegeln und mit folgenden Konsequenzen gerechnet werden muss.

  1. Bei Messungen im zeitlichen Verlauf werden Trends vorgetäuscht oder verschleiert, wenn sich die präanalytischen Bedingungen ändern. So steigt z. B. die Hämoglobinkonzentration bei Blutentnahme im Sitzen gegen über der Blutentnahme im Liegen an. Bei gesunden jungen Personen ist diese Veränderung vernachlässigbar gering, jedoch bei herzinsuffizienten Patienten kann diese Änderung 10 % des Messwertes überschreiten.
  2. Die Messwerte können falsch außerhalb oder falsch innerhalb des Referenzbereichs liegen, was zu diagnostischen Fehlschlüssen führen kann, denn bei der Ermittlung von Referenzwerten erfolgt die Probenentnahme unter Standardbedingungen. An den Beispielen unter „häufige präanalytische Fehler“ wird der Sachverhalt an einer Pseudothrombozytopenie deutlich gemacht.

Zwischen 7 und 10 Uhr morgens, nüchtern, (keine Medikamente, nicht rauchen), (Blutentnahme im Sitzen) bei ambulanten Patienten, bei stationären Patienten im Liegen.

Cubitalvene, kurz gestaut - Kapillarblutentnahme nur in Ausnahmefällen z. B. bei Neugeborenen und anderen Patienten mit besonders schwieriger Gewinnung von Venenblut.

EDTA-Monovette oder EDTA-Vacutainer.

Probenlagerung und Transport von der Probenentnahme bis zur Analyse innerhalb von 6 h.

Da bei der Probengewinnung für die Ermittlung von Referenzwerten die Standardbedingungen eingehalten und präanalytische Fehler mimimiert wurden, sollten bei der Probenentnahme vom Patienten ebenfalls die Standardbedingungen eingehalten werden. Die Patientenwerte werden mit den Referenzwerten verglichen und dem entsprechend als erhöht oder erniedrigt oder als im Referenzbereich liegend eingestuft.

Tagesrhythmik (Probenentnahme zu verschiedenen Tageszeiten) – Für Leukozyten und Hämoglobin wurden Schwankungen im Verlauf des Tages (morgens 20 % höher als nachmittags) und Variationen von einem zum nächsten Tag für Leukozyten (bis zu 50 %) und Thrombozyten (bis zu 45 %) beschrieben.

Literatur:
  • Einer G, Zawta B. Präanalytikfibel. JA Barth Verlag 1991, Leipzig

Hämokonzentration fasst die Veränderungen durch längeres Stauen der Venen bei der Probenentnahme, Blutentnahme in wechselnder Körperhaltung (mal im Liegen, mal im Sitzen), und Blutentnahme nach körperlicher Belastung zusammen.
- Die Hämokonzentration führt zur Wasserverschiebung aus dem Intravasalraum in den Extravasalraum, die Konzentration der zellulären Bestandteile und der Eiweiße nimmt im Blut zu. Während Erythrozyten und Hämoglobinkonzentration entsprechend der Wasserverschiebung zunehmen, kann der Anstieg der Leukozytenzahlen bei Hämokonzentration durch hormonelle Einflüsse die auf die Ursache der Hämokonzentration zurückgehen wesentlich stärker ausfallen. So führt z. B. eine sportbedingte Katecholaminausschüttung zur Freisetzung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten aus dem marginalen Pool ins strömende Blut.
Aus diesem Grund ist die Leukozytendifferenzierung nach körperlicher Belastung aber auch bei psychischer Belastung ohne Hämokonzentration ausgelenkt.

Literatur:
  • A. Weimann, A. Lun, S. Lun, M. Zimmermann, A. C. Borges, R. Ziebig, J. B. Gonzalez, S. Gilka Munoz Saravia, F. Knebel, S. Schroeckh and I. Schimke. Leukocyte, neutrophil, immature granulocyte counts and interleukin-6 are superior to procalcitonin, C-reactive protein and delta-He for detection of mild inflammation: data from marathon runners producing mild systemic inflammation visible immediately after the run J Lab Med 2010;34:53–59

Details zu den Veränderungen des Blutbildes nach schwerer körperlicher Belastung

Bei herzinsuffizienten Patienten kann schon der höhere Blutdruck im Sitzen als im Liegen zu 10 Prozent höheren Werten für Hämoglobinkonzentration, Hämatokrit, Erythrozyten- und Thrombozytenzahl führen. Die Unterschiede zwischen Liegen und Sitzen sind bei jungen, kardial-gesunden Personen mit ca. 3 % vernachlässigbar gering.

Literatur:
  • Martínez AC, Cámara FJ, Vicente GV. Status and metabolism of iron in elite sportsmen during a period of professional competition. Biol Trace Elem Res. 2002 Dec;89(3):205-13.
  • Einer G, Zawta B. Präanalytikfibel. JA Barth Verlag 1991, Leipzig

Eine Verlängerung der Stauungszeit von 1 auf 3 min führte zum Anstieg von Erythrozytenzahl um 3 % und zum Abfall der Leukozytenzahl um 8 %. Bei längerer Stauung (5 bis 10 min) kann die Leukozytenzahl noch deutlicher abfallen. Ursache ist die Anlagerung der Leukozyten an die stauungsbedingt aktivierten Endothelzellen der Gefäßwände.

Literatur:
  • Ziemer S. persönliche Mitteilung
  • Einer G, Zawta B. Präanalytikfibel. JA Barth Verlag 1991, Leipzig
  • van Eeden SF, Granton J, Hards JM, Moore B, Hogg JC. Expression of the cell adhesion molecules on leukocytes that demarginate during acute maximal exercise. J Appl Physiol. 1999 Mar;86(3):970-6.

Hämokonzentration wird auch beim Aufenthalt unter hohen Temperaturen und Schwitzen beobachtet.

Kapillarblutentnahme – Die Messwerte des Blutbildes aus Kapillarblut repräsentieren den Gesamtkreislauf schlechter als die Messwerte aus Venenblut. Im direkten Vergleich findet man klinisch bedeutsam höhere Leukozytenzahlen im Kapillarblut (1000 – 4000 Leukozyten /µl), so dass eine Leukopenie übersehen werden kann. Weil bei der Kapillarblutentnahme trotz Hyperämisierung meist noch gequetscht werden muss, kommt es zur Beimengung von Gewebeflüssigkeit und das Blut kann bis zu 15 % verdünnt werden. Nacheinander entnommene Bluttropfen können sich in der Zellkonzentration deutlich unterscheiden.

Literatur: 
  • Bain BJ. Blood cells. Blackwell Science, 1995

Frauen haben niedrigere Hämoglobinkonzentration, Erythrozytenzahlen und Hämatokritwerte und höhere Leukozyten-, Neutrophilen-, Monozyten- und Thrombozytenwerte als Männer. Kaukasier haben höhere Leukozyten-, Neutrophilen-, Monozyten- und Thrombozytenwerte als Afrikaner.

Literatur:
  • Bain BJ. Ethnic and sex differences in the total and differential white cell count and platelet count. J Clin Pathol 1996; 49: 664-666

führt über Freisetzung von Katecholaminen zur Ausschwemmung von Neutrophilen aus dem marginalen Pool (Splanchnicusvenen und Lungenendstrombahn) ins periphere Blut. Innerhalb von Sekunden steigen die Leukozyten an. Die Katecholamine führen zum Einklappen der Adhäsionsmoleküle, die unter Normalbedingungen einen Teil der Neutrophilen an den Gefäßendothelien des marginalen Pools festhalten.

Ein leichtes (fettarmes) Frühstück zeigte nur geringen Einfluss auf die Parameter des roten Blutbildes und die Leukozytenzahlen (weniger als 5 % Auslenkung).

Literatur:
  • Guder W. et al. Proben zwischen Patient und Labor. Git-Verlag, 1999; S. 8

Dem gegenüber führt fettreiches Essen 1 bis 6 Stunden nach dem Essen zu einem relevanten Anstieg der Leukozytenzahlen (größer 30 %).

Literatur:
  • Rabelink TJ, de Boer HC, van Zonneveld AJ. Endothelial activation and circulating markers of endothelial activation in kidney disease. Nat Rev Nephrol. 2010 Jul;6(7):404-14.
  • van Oostrom AJ, Plokker HW, van Asbeck BS, Rabelink TJ, van Kessel KP, Jansen EH, Stehouwer CD, Cabezas MC. Effects of rosuvastatin on postprandial leukocytes in mildly hyperlipidemic patients with premature coronary sclerosis. Atherosclerosis. 2006 Apr;185(2):331-9. Epub 2005 Aug 10.
  • G. Lippi, G. Lima-Oliveira, G. Luca Salvagno, M. Montagnana, M. Gelati, G. Picheth, A. José Duarte, M. Franchini, G. Cesare Guidi. Influence of a light meal on routine haematological tests. Blood Transfus 2010; 8: 94-9

vor der Probenentnahme erhöht Leukozytenzahl, Erythrozytenzahl und Hämoglobinkonzentration.

Literatur:
  • Einer G, Zawta B. Präanalytikfibel. JA Barth Verlag 1991, Leipzig

Raucherentwöhnung

2 Wochen nach Ende des Rauchens wurden signifikante Verminderungen von Hämoglobinkonzentration (2 %), Hämatokrit (5 %), Erythrozyten- (3 %), Leukozyten (12 %) und Thrombozytenzahl (5 %) gemessen.

Literatur:
  • Bain et al. Acute changes in haematological parameters on cessation of smoking. Journal of the Royal Society of Medicine 85; 1992: 80-82

Tagesrhythmus

Die Anzahl der Leukozyten und der Neutrophilen war morgens 0,5 Leukozyten /nl höher als nachmittags.

EDTA-induzierte Thrombozytopenie (Pseudothrombozytopenie) ist ein Laborphänomen. Autoantikörper gegen Thrombozyten des EDTA-antikoagulierten Blutes führen zur Aggregation der Thrombozyten. Nur die nicht aggregierten Thrombozyten werden vom Hämatologieautomaten erkannt und gezählt. Die Folge ist ein falsch verminderter Thrombozyten-Meßwert (Pseudothrombozytopenie). Thrombozytenaggregate werden im Messmodus großes Blutbild erkannt nicht aber im Modus kleines Blutbild. Deshalb ist eine Fehlinterpretation Thrombozytopenie im Messmodus kleines BB möglich und der falsche Thrombozytenwert wird herausgegeben. Im Modus großes BB werden die Thrombozytenaggregate als Alarm angezeigt und die falsch niedrige Thrombozytenzahl wird nicht an den Arzt weiter gegeben, um keine Fehlinterpretation zuzulassen und unnötige diagnostische Schritte zu vermeiden. Eine exakte Thrombozytenzahl lässt sich dann aus dieser Probe nicht bestimmen.
Bei EDTA-induzierter Thrombozytopenie wird die Verwendung von Citrat an Stelle von EDTA als Antikoagulans oder die Nutzung einer „Thrombo-exakt“ Monovette für die Bestimmung der Thrombozytenzahl empfohlen.

Riesenthrombozyten, wie sie u. a. bei myelodysplastischem Syndrom vorkommen, können mit dem k-BB Modus (Impedanzmessung) nicht korrekt bestimmt werden. Die zusätzliche optische Messung im Retikulozytenkanal (großes-BB + Reti) wird erforderlich.

Anlagerung der Thrombozyten an Leukozyten (Satellitenphänomen) führt zu Pseudothrombozytopenie, die Thrombozyten können nicht korrekt bestimmt werden. Dieser Sachverhalt wird im k-BB Modus nicht erkannt, im g-BB Modus wird auf Grund der veränderten Leukozytengröße ein Alarm gesetzt und eine mikroskopische Kontrolle angefordert.

Gerinnsel - Bei sehr langsamem Blutfluss in das Probenröhrchen kann es bereits im Abnahmesystem zu Gerinnseln kommen, ehe das Blut mit dem Antikoagulanz in Kontakt tritt. Die Folge sind nicht repräsentative Messwerte insbesondere verminderte Thrombozytenzahlen.

Hämolyse in der Blutprobe kann durch Schaumbildung (Schütteln), Hitze oder Einfrieren (Kontakt des Probenröhrchens mit dem Kühlakku) beim Probentransport oder als Folge zu langer Lagerung der Blutprobe (länger als 24 h) auftreten. Um Parameter des EDTA-Blutes wie Anzahl der Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten relevant zu ändern, muss die Hämolyse massiv sein. Logischerweise wird die Hämoglobinkonzentration des Blutes durch Hämolyse nicht verändert, denn die Hb-Messung des Vollblutes erfasst beide zelluläre und plasmatische Komponenten des Blutes.

In einer eigenen kleinen Studie an ca. 20 EDTA-Blutproben konnten wir die Lagerungsstabilität über 2 Tage für die Parameter RBC, Hämoglobinkonzentration, MCH und Thrombozytenzahl bei Zimmertemperatur bestätigen, die auch andere Autoren fanden.

Literatur:
  • Guder W et al. Kompendium Präanalytik - Fokus Patientenprobe. CD, 2007

In unserer Studie zeigten sich jedoch die Leukozytenzahlen bereits nach 48 h signifikant vermindert und die Parameter Hämatokrit, MCV nach 12 bis 16 h Lagerung bzw. MPV nach 48 h deutlich erhöht.

Da sich Hämatokrit und MCV durch Wasserverschiebungen zwischen Intrazellularraum und Plasma schon während kurzer Lagerung verändern, sollte das Blutbild innerhalb von 6 h nach Probenentnahme gemessen werden.

Empfehlung:
Automatenblutbild innerhalb von sechs Stunden durchführen.
Ausstrich innerhalb von drei Stunden anfertigen.

Lagerung bei Zimmertemperatur in EDTA-Monovetten
Die linken Grafiken zeigen die gemessenen Werte der Basisparameter über die Zeit, die rechten Grafiken zeigen die auf den Ausgangswert als 100 % normierten Werte und die analytische Präzision als 2 s-Bereich (zwischen den roten Linien).

Die Abbildungen 2-5 zeigen, dass

  • die Parameter RBC, Hämoglobinkonzentration, MCH über 48 h stabil sind und präzise gemessen werden.
  • die Thrombozytenzahl nicht so präzise gemessen wird, aber auch über 48 h stabil ist.
  • die Leukozytenzahl bereits nach 48 h vermindert ist und Hämatokrit, MCV nach 24 h, bzw. MPV nach 48 h deutlich erhöht sind.

Schon nach 24 h sind die normierten Hämatokritwerte außerhalb des 3-fachen Streubereichs der analytischen Präzision, während die Leukozytenzahlen diesen Bereich erst nach 48 h verlassen. Die 3-fache Standardabweichung der analytischen Präzision wurde gewählt, weil Differenzen zwischen 2 Messwerten von größer 2,8 Streubreiten der analytischen Präzision als signifikante Differenzen angenommen werden können (Irrtumswahrscheinlichkeit 5 %).

Klinische Situation: Geplante Operation; präoperative Kontrolle des Blutbildes im Modus k-BB
Bei der Blutentnahme kam es durch beginnende Gerinnung im Butterfly-Abnahmesystem zum Abbruch des Blutflusses. Der Blutstrom war bei halber Füllung des Probenröhrchens abgebrochen und dieses Probenröhrchen wurde zur Untersuchung des kleinen Blutbildes ins Labor geschickt, siehe Abbildung 7.

Abb. 7 Messung einer Blutprobe mit Thrombozytenaggregaten

Die auffällig niedrige Thrombozytenzahl und der auffällige Befund „das Tal im Histogramm erreicht nicht die Basislinie „ (Bildmitte Pfeil ) führt im Labor zu folgenden Reaktionen.

  • Vergleich mit den Vorwerten und visuelle Kontrolle des Probenröhrchens auf Gerinnsel
    • Sichtbare Gerinnsel --> Kein Ergebnis ausgeben und neue Probenanforderung
    • Kein sichtbares Gerinnsel --> Kontrollmessung im Modus g-BB mit Retikulozyten

In diesem Fall war kein Gerinnsel sichtbar und eine Kontrolluntersuchung im Modus g-BB erfolgte, siehe Abb. 7 rechts, die Thrombozytenaggregate im IMI-Kanal zeigte. Dies führte zur Anforderung einer neuen Blutprobe.

Abb. 8  Die Untersuchung aus einer neuen Blutprobe; in diesem Fall war der Blutfluss bei der Blutentnahme nicht gestört.

Bei der neuen Blutentnahme traten keine Probleme bei der Messung auf. Das Thrombozytenhistogramm erreichte im Tal zwischen Thrombozyten und Erythrozyten die Basislinie (senkrechter Pfeil) und im IMI-Kanal waren keine Thrombozytenaggregate zu sehen. Damit war die Messung technisch korrekt. Bei dieser Messung war die Thrombozytenzahl im Referenzbereich.

  • keine Alarme, die Histogrammkurve (Mitte) erreicht die Basislinie, im IMI-Kanal keine Thrombozytenaggregate; das bedeutet: die Messwerte sind korrekt!
  • keine Thrombozytopenie, das bedeutet: keine Kontraindikation für die bevorstehende Operation.
  • Achtung! Durch die Thrombozytenaggregate wurde nicht nur die Thrombozytenzahl sondern auch Leukozyten und Erythrozyten falsch bestimmt (erste Messung).

Schlussfolgerung: Fehler bei der Probenentnahme, wie ungenügende Durchmischung, oder Thrombozytenaggregate oder Gerinnsel, können durch perfekte Analytik nicht mehr korrigiert und bestenfalls erkannt werden, Modus g-BB.
Klinische Relevanz: Unkritische Akzeptanz der Fehlbestimmung „Thrombozytopenie“ hätte in dem oben ausgeführten Fall die Operation verzögert.

Eine Thrombozytopenie ohne Vorwerte wird prinzipiell überprüft, denn präanalytische Fehler, Heparin-induzierte, oder immunologisch bedingte Thrombozytopenien müssen abgeklärt werden.